靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达

作     者：边中启 孙璐璐 陈维灶 肖安 马世武 崔志磊 刘霜 刘明秋 严维耀 郑兆鑫 BIAN Zhong-qi;SUN Lu-lu;CHEN Wei-zao;XIAO An;MA Shi-wu;CUI Zhi-lei;LIU Shuang;LIU Ming-qiu;YAN Wei-yao;ZHENG Zhao-xin

作者机构：成都军区昆明总医院传染病中心昆明650032 复旦大学遗传所 

基　　金：基金项目:国家自然科学基金(30972629) 

出 版 物：《中华医学杂志》 (National Medical Journal of China)

年 卷 期：2010年第90卷第39期

页      码：2776-2781页

摘      要：目的 研究靶向乙型肝炎病毒（HBV）C基因的shRNA（shRNA）诱导RNAi（RNAi）在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组（基因型B属ayw1亚型）已在GenBank登录注册：CYN/2002和CYN/2000（GenBank登录号AY517488,AY517489,等）,为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B（-）,设计并构建两个靶向同源（CYN/2002和CYN/2000）毒株HBV C基因的长24核苷酸（nt）的shRNA表达质粒（S1和S2）,随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（EGFP）表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1＋S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.01） 应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义（P＜0.01）.进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h.结果 发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达.结论 靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达.RNAi可能成为抗重大传染病HBV/HCV安全有效的应急疫苗.

主 题 词：肝炎病毒,乙型 RNA干扰 短发夹状RNA 微RNA 应急疫苗 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100210[100210] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2010.39.011

馆 藏 号：203101059...