构建模拟人致病位点突变的靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统

作     者：岳鹏鹏 黎成钦 农月娟 陈玲 付灿 于鸿浩 YUE Peng-peng;LI Cheng-qin;NONG Yue-juan;CHEN Ling;FU Can;YU Hong-hao

作者机构：桂林医学院生物技术学院广西桂林541199 

基　　金：国家自然科学基金(31860302) 广西自然科学基金(2018JJA140455) 广西科技计划项目(2019AC20329) 广西中青年教师能力提升项目(2018KY0399) 

出 版 物：《基础医学与临床》 (Basic and Clinical Medicine)

年 卷 期：2021年第41卷第3期

页      码：325-332页

摘      要：目的建立可模拟人类KRT14强致病位点突变的高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统。方法本研究通过检索多个数据库筛查人类单纯性大疱性表皮松懈症(EBS)致病的基因KRT14强致病突变位点,并通过人和小鼠KRT14蛋白序列比对分析将筛查到的强致病位点定位于小鼠基因组上。根据CRISPR/Cas9系统的基因打靶原理,设计了4个靶向小鼠Krt14的单导RNA(sgRNA),并对应构建了4个sgRNA表达质粒。将sgRNA表达质粒分别与Cas9表达质粒共转染小鼠NIH 3T3细胞,转染细胞经过药物筛选、PCR扩增产物测序、TA克隆测序等实验验证4个sgRNAs的打靶效率。结果根据数据库筛查结果判定人KRT14蛋白的***125位点为强致病位点,与小鼠KRT14蛋白的***131位点相对应;根据小鼠***131位点的DNA序列,成功构建了4个靶向该位点的sgRNA表达质粒;药筛阳性细胞打靶位点的PCR扩增产物测序表明4个位点均发生了突变;TA克隆测序结果表明4个位点的突变效率分别为70%、90%、65%和100%。结论根据数据库筛查的人KRT14强致病位点,成功构建了高效靶向小鼠Krt14的CRISPR/Cas9系统,为深入研究KRT14的功能以及建立KRT14基因编辑小鼠模型、探讨疾病的机制和治疗方法奠定基础。

主 题 词：单纯性大疱性表皮松懈症 KRT14 基因编辑 CRISPR/Cas9 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.16352/j.issn.1001-6325.2021.03.004

馆 藏 号：203102465...