早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响

作     者：李文锐 张媛媛 贾苇雪 何艳艳 徐浩翔 林麟 李诚让 Li Wenrui;Zhang Yuanyuan;Jia Weixue;He Yanyan;Xu Haoxiang;Lin Lin;Li Chengrang

作者机构：中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病医院皮肤科南京210042 江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室南京210042 

基　　金：国家自然科学基金(81472872) 中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2016-I2M-1-002) 

出 版 物：《中华皮肤科杂志》 (Chinese Journal of Dermatology)

年 卷 期：2021年第54卷第4期

页      码：318-324页

摘      要：目的构建早老蛋白增强子2(PSENEN)基因沉默的人永生化角质形成细胞(HaCaT)模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染:shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR(qPCR)、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白(NCT)、早老蛋白1(PS1)、前咽缺陷蛋白1a(APH1a)mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组(1.054±0.272、1.076±0.075)相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA(0.187±0.010、0.163±0.022、0.174±0.009)、蛋白(0.219±0.097、0.208±0.014、0.185±0.062)表达均显著降低(均P0.05);shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组(均P0.05),mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义(F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P≤0.01)。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低(均P0.05)。结论成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

主 题 词：化脓性汗腺炎 基因沉默 细胞增殖 PSENEN基因 γ分泌酶 HaCaT细胞 

学科分类：1004[医学-公共卫生预防医学类] 1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 100206[100206] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.35541/cjd.20201144

馆 藏 号：203102916...