TEAD1基因敲除对糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响

作     者：张涛 李维丽 邱晓拂 刘百川 李高远 冯才鑫 廖俊发 林康健 ZHANG Tao;LI Weili;QIU Xiaofu;LIU Baichuan;LI Gaoyuan;FENG Caixin;LIAO Junfa;LIN Kangjian

作者机构：广东省第二人民医院泌尿外科广东广州510317 南方医科大学南方医院妇产科广东广州510515 

基　　金：国家自然科学基金青年科学基金(81601273) 广东省中医药局科研项目(20192004) 

出 版 物：《南方医科大学学报》 (Journal of Southern Medical University)

年 卷 期：2021年第41卷第4期

页      码：567-573页

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9技术敲除糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMCs)中TEAD1基因,探讨TEAD1基因对糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型转化的影响。方法利用链脲佐菌素建立糖尿病性ED大鼠模型。原代及传代培养CCSMCs,并进行免疫荧光染色鉴定。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则设计了3组特异性sgRNA(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3),构建表达载体并转染293T细胞,包装并收集慢病毒,将其感染糖尿病性ED大鼠CCSMCs,嘌呤霉素筛选阳性细胞,Western blot检测TEAD1蛋白的表达水平。然后将实验分3组:敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs为实验组(CCSMCs-sgRNA-2)、空载体病毒感染组为阴性对照组(CCSMCs-sgRNA-NC)、不感染病毒组为空白对照组(CCSMCs-CK),分别使用qRT-PCR和Western blot检测各组细胞表型标志物平滑肌肌球蛋白重链(SMMHC)、碱性调宁蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)mRNA和蛋白水平的表达。结果原代培养的糖尿病性ED大鼠CCSMCsα-SMA阳性细胞率达95%以上。成功包装了含有TEAD1-sgRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs细胞系。Western blot结果显示感染TEAD1-sgRNA-2的糖尿病性ED大鼠CCSMCs中TEAD1蛋白水平最低(P<0.05)。qRT-PCR和Western blot结果显示,敲除TEAD1基因的糖尿病性ED大鼠CCSMCs,SMMHC和Calponin mRNA和蛋白水平的表达均显著上调(P<0.05),而PCNAmRNA和蛋白水平的表达均显著减少(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas9基因技术成功构建了定向敲除TEAD1基因的慢病毒载体,TEAD1基因的缺失可使糖尿病性ED大鼠CCSMCs表型从合成型向收缩型转化。

主 题 词：TEAD1 勃起功能障碍 糖尿病 平滑肌细胞 表型转化 CRISPR/Cas9 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100210[100210] 100201[100201] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.12122/j.issn.1673-4254.2021.04.13

馆 藏 号：203102953...