虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)TaqManRT-PCR检测方法的建立与应用

作     者：桑松文 李小平 张庆利 SANG Songwen;LI Xiaoping;ZHANG Qingli

作者机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 

基　　金：国家重点研发计划项目(2017YFC1404503) 中国水产科学研究院基本科研业务费(2020TD39) 中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费项目(20603022019003)共同资助 

出 版 物：《渔业科学进展》 (Progress in Fishery Sciences)

年 卷 期：2021年第42卷第5期

页      码：77-85页

摘      要：基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法。优化后的反应组分:20.0μL TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、0.4μmol/L探针、1.0μL模板和5.2μL RNA-free H2O;优化后的反应程序:54.5℃15 min,95℃1 min;45个热循环扩增(95℃10 s,60.3℃30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×10^(10)-1.4×10^(1 )copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×10^(1)拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5%(16/68)。本研究建立的MDNV TaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。

主 题 词：养殖对虾 行动障碍野田村病毒(MDNV) TaqMan RT-PCR 定量 检测方法 

学科分类：0908[0908] 09[农学] 

核心收录：

D　O　I：10.19663/j.issn2095-9869.20200331001

馆 藏 号：203104722...