利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

作     者：王丹丹 胡勇 方毅 韩秀晶 刘曜宁 靳彦文 曹诚 WANG Dan-dan;HU Yong;FANG Yi;HAN Xiu-jing;LIU Yao-ning;JIN Yan-wen;CAO Cheng

作者机构：安徽医科大学解放军307临床学院合肥230032 解放军总医院第五医学中心内分泌科北京100071 军事科学院军事医学研究院生物工程研究所北京100850 广州医科大学附属第一医院检验科广州510120 

基　　金：国家重点研发项目(2018YFC1200701) 

出 版 物：《军事医学》 (Military Medical Sciences)

年 卷 期：2021年第45卷第7期

页      码：493-499页

摘      要：目的使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果。使用高通量测序的方法进行基因表达分析。用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖。结果成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响。结论利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能。

主 题 词：CRISPR/Cas9 甲状腺激素受体相关蛋白3 HepG2细胞 基因编辑 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 100214[100214] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

D　O　I：10.7644/j.issn.1674-9960.2021.07.003

馆 藏 号：203104734...