绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

作     者：蒙亚琦 姚旭东 任秀美奥 郭延华 唐红 张译元 王立民 周平 MENG Yaqi;YAO Xudong;REN Xiumeiao;GUO Yanhua;TANG Hong;ZHANG Yiyuan;WANG Limin;ZHOU Ping

作者机构：石河子大学动物科技学院石河子832000 新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室石河子832000 

基　　金：兵团中青年科技创新人才计划(2019CB002) 转基因羊再克隆早期胚胎发育质量的研究(2013KLS05) 高产超细毛转基因羊新品种培育(2016ZX08008001) 国家自然科学基金(31660341) 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2021年第48卷第10期

页      码：3533-3544页

摘      要：研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊(Ovis aries)成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)寡核苷酸链(sgRNA-T1~sgRNA-T4),构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用CruiserTM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被CruiserTM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max(ng/μL)∶sgRNA(ng/μL)=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA(T1、T4);通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。

主 题 词：绵羊 成纤维细胞生长因子5(FGF5) 单碱基编辑 

学科分类：0905[农学-林学类] 09[农学] 

D　O　I：10.16431/j.cnki.1671-7236.2021.10.004

馆 藏 号：203105271...