利用CRISPR/Cas9n系统编辑绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因

作     者：蒙亚琦 姚旭东 任秀美奥 郭延华 唐红 张译元 王立民 周平 MENG Yaqi;YAO Xudong;REN Xiumeiao;GUO Yanhua;TANG Hong;ZHANG Yiyuan;WANG Liming;ZHOU Ping

作者机构：石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院新疆石河子832000 

基　　金：转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08008001) 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖重点实验室(2013KLS05) 国家自然科学基金(31660341) 

出 版 物：《畜牧与兽医》 (Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2022年第54卷第1期

页      码：8-15页

摘      要：成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据。

主 题 词：绵羊 成纤维细胞生长因子5 CRISPR/Cas9n 基因敲除 

学科分类：0905[农学-林学类] 09[农学] 

馆 藏 号：203107106...