牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

作     者：高辉 李晓成 刘莹 袁野 张欣怡 尼博 张慧 段纲 董雅琴 魏荣 GAO Hui;LI Xiaocheng;LIU Ying;YUAN Ye;ZHANG Xinyi;NI Bo;ZHANG Hui;DUAN Gang;DONG Yaqin;WEI Rong

作者机构：云南农业大学动物医学院昆明650201 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032 天津市动物疫病预防控制中心天津300402 

出 版 物：《黑龙江畜牧兽医》 (Heilongjiang Animal Science And veterinary Medicine)

年 卷 期：2022年第6期

页      码：86-91页

摘      要：为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列,设计引物及小沟结合物(MGB)探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验。利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测,并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证。结果表明:建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.8μL,2×One Step RT-PCR BufferⅢ10μL,Ex Taq HS(5 U/μL)0.4μL,Prime Script RT Enzyme MixⅡ0.4μL,总RNA 2μL,ddH_(2)O 4.4μL;扩增程序为,42℃5 min;95℃10 s;95℃5 s,55℃35 s,40个循环。标准曲线方程为y=40.979-3.512x,可信度(R^(2))为0.999,扩增效率(E)为92.6%,最低检测限为48 copies/μL,重复性变异系数(CV)不超过0.82%。31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52%(20/31),其中腹泻症状阳性场占比为54.55%(12/22),呼吸道症状阳性场占比为65.22%(15/23);阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证,测序正确。说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,能检测出临床样本中的BCoV核酸,可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查。

主 题 词：牛冠状病毒 小沟结合物(MGB) 实时荧光定量RT-PCR 检测方法 流行病学调查 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2021.09.0301

馆 藏 号：203109193...