靶向沉默巨噬细胞中 Mcl-1基因 shRNA表达质粒的构建与鉴定

作     者：王婵 王新敏 王飞雨 张雨晴 曹旭东 吴江东 吴芳 张万江 章乐 WANG Chan;WANG Xin-min;WANG Fei-yu;ZHANG Yu-qing;CAO Xu-dong;WU Jiang-dong;WU Fang;ZHANG Wan-jiang;ZHANG Le

作者机构：石河子大学医学院病原生物学与免疫学教研室新疆石河子832002 石河子大学新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科新疆石河子832002 石河子大学医学院病理生理学教研室新疆石河子832002 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(No.81260241) 石河子大学项目(No.RCZX200922) 

出 版 物：《西安交通大学学报（医学版）》 (Journal of Xi’an Jiaotong University（Medical Sciences）)

年 卷 期：2015年第36卷第4期

页      码：558-564页

摘      要：目的研究髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)基因在小鼠巨噬细胞Raw264.7和人巨噬细胞THP-1中的表达情况,筛选出表达含量高的细胞株作为实验用细胞,根据筛选的结果构建靶向小鼠Mcl-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒进行转染,最后筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒。方法利用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分别检测两种巨噬细胞中Mcl-1mRNA和蛋白表达情况。采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段,由公司构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(Mcl-1shRNA1-3),然后通过脂质体将真核表达质粒载体转染到小鼠巨噬细胞株Raw264.7中,24、48h后通过倒置荧光显微镜观察转染效果,并分别采用实时定量PCR和Western blot检测Mcl-1mRNA和蛋白表达情况。结果小鼠巨噬细胞Raw264.7中Mcl-1的mRNA及蛋白质的表达显著高于人巨噬细胞,差异有统计学意义(P<0.05);构建的shRNA表达载体在24、48h均能降低Raw264.7细胞内mcl-1mRNA和蛋白水平,尤其在48h沉默效果最为明显;转染48h后与正常组、脂质体组和阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);与Mcl-1shRNA1和Mcl-1shRNA2相比,Mcl-1shRNA3对Mcl-1mRNA和蛋白的沉默作用最强。结论成功筛选出了实验所用细胞Raw264.7及对小鼠巨噬细胞Raw264.7内Mcl-1具有明显沉默效果的靶向Mcl-1shRNA3真核表达质粒。

主 题 词：髓细胞白血病-1基因 Raw264.7细胞 THP-1细胞 结核分枝杆菌 短发夹RNA 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100102[100102] 10[医学] 

D　O　I：10.7652/jdyxb201504027

馆 藏 号：203110501...