苏云金芽孢杆菌伴孢晶体20kb DNA中cry1Ac基因的克隆、高效表达和生物活性研究

作     者：胡宏源 夏立秋 史红娟 孙运军 高必达 丁学知 HU Hong Yuan 1 XIA Li Qiu 1 SHI Hong Juan 1 SUN Yun Jun 1 GAO Bi-Da 2 DING Xue Zhi 1,2* 1(Department of Microbiology, College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China) 2(College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

作者机构：湖南师范大学生命科学学院微生物学系长沙410081 湖南农业大学植物保护学院长沙410128 

基　　金：国家"8 63计划"(No.2 0 0 2AA2 45 0 2 1) 国家自然科学基金 (No .3 0 2 70 0 3 7) 湖南省自然科学基金 (No.0 3JJY3 0 2 5 ) 

出 版 物：《生物工程学报》 (Chinese Journal of Biotechnology)

年 卷 期：2004年第20卷第5期

页      码：656-661页

摘      要：已经证实苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis,Bt)伴孢晶体结合 2 0kbDNA ,但其序列特异性及作用有待进一步研究阐明。研究了选择性溶解Bt 4 0 718菌株Cry1类原毒素所形成的菱形伴孢晶体 ,从中抽提出与其结合的 2 0kbDNA。经NdeⅠ酶切消化后亚克隆构建文库 ,通过PCR RFLP及测序筛选出含cry1Ac基因的转化子。然后设计引物PCR扩增出cry1Ac基因的ORF并与pET30a连接 ,转化E .coliBL2 1(DE3) ,高效表达了 14 1kD蛋白。表达蛋白占总蛋白量的 5 0 %以上 ,且 90 %以上以包涵体形式存在。利用穿梭载体pHT30 4构建表达质粒pHTX4 2 ,电转化Bt无晶体突变株XBU0 0 1,获得重组菌株HTX4 2 ,经SDS PAGE分析 ,cry1Ac基因得到强表达 ,蛋白质定量分析显示目的蛋白量占总蛋白量的 79 2 8% ,且其在细胞中累积达细胞干重的 6 4 13% ,比文献报道的 2 5 %左右高了 1倍以上。原子力显微镜 (AtomicForceMicroscopy ,AFM)检测显示 ,目的基因在大肠杆菌 (E .coli)中表达的包涵体呈不规则形状且较小 ,而在无晶体突变株中表达的晶体呈典型菱形晶体 ,大小约为 1 2 μm× 2 0 μm。生测结果显示 ,包涵体与晶体对小菜蛾 (Plutellaxylostella)幼虫均有高效杀虫活性。本研究为构建高效杀虫工程菌及进一步阐明Bt伴孢晶体中 2 0kbDNA分?

主 题 词：苏云金芽孢杆菌 伴孢晶体 20kbDNA cry1Ac基因 表达 小菜蛾 克隆 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.3321/j.issn:1000-3061.2004.05.004

馆 藏 号：203110934...