利用CRISPR/Cas9技术构建 MLH1 基因敲除结肠癌细胞Mc38和乳腺癌细胞4T1及其微卫星状态鉴定

作     者：刘名安 李辉严 李建明 柳玉红 LIU Mingan;LI Huiyan;LI Jianming;LIU Yuhong

作者机构：南方医科大学第二临床医学院广东广州510000 深圳市宝安区人民医院病理科广东深圳518101 中山大学孙逸仙纪念医院病理科广东广州510120 

基　　金：国家自然科学基金项目(81472316) 深圳市宝安区科技计划医疗卫生基础研究项目(2019JD028) 

出 版 物：《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 (Journal of Jinan University(Natural Science & Medicine Edition))

年 卷 期：2022年第43卷第2期

页      码：179-190页

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制提供细胞模型。方法:设计2条特异性靶向MLH1基因的SgRNA序列,构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体,经PCR、测序鉴定;将lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体分别和慢病毒包装骨架质粒pMD2.G、psPAX2共转染293T细胞构建lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体;利用lentiCRISPRv2-SgRNA慢病毒载体分别感染Mc38、4T1细胞,经嘌呤霉素和96孔板流式分选筛选出阳性单克隆细胞后PCR、Western Blot和测序鉴定;MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞连续培养约70 d,经荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星状态检测,筛选MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结果:测序结果表明成功构建lentiCRISPRv2-SgRNA重组质粒载体;PCR、Western Blot和测序结果表明成功构建MLH1-/-Mc38细胞、MLH1-/-4T1细胞;荧光PCR-毛细管电泳结果表明成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定Mc38、4T1细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建MLH1基因敲除的微卫星不稳定鼠源性结肠癌细胞Mc38和鼠源性乳腺癌细胞4T1,为后续深入研究微卫星不稳定肿瘤在抗肿瘤免疫治疗过程中的作用机制奠定了基础。

主 题 词：CRISPR/Cas9基因编辑技术 MLH1 微卫星不稳定肿瘤 免疫治疗 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1002[医学-临床医学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 100214[100214] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 10[医学] 

D　O　I：10.11778/j.jdxb.2022.02.009

馆 藏 号：203111031...