蛋白激酶AMPK高效制备及活性检测方法的建立

作     者：陈进 郭鑫鑫 李芯蕊 朱秋美 王蕊红 顾玉超 CHEN Jin;GUO Xin-xin;LI Xin-rui;ZHU Qiu-mei;WANG Rui-hong;GU Yu-Chao

作者机构：中国海洋大学医药学院山东青岛266003 青岛市中心医院门诊部山东青岛266042 

基　　金：国家自然科学基金项目(81871868 U1706210 31870795)资助 

出 版 物：《中国海洋药物》 (Chinese Journal of Marine Drugs)

年 卷 期：2022年第41卷第2期

页      码：43-48页

摘      要：目的 建立高效的腺苷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)的制备方法,并建立1种基于酶联免疫吸附(ELISA)法的AMPK的激酶活性检测方法以用于药物筛选。方法 利用大肠杆菌表达系统,将AMPK的α、β和γ 3个亚基与钙调素依赖性蛋白激酶β(CAMKK β)共表达,重组AMPK被CAMKK β磷酸化修饰并激活,进而纯化得到具有激酶活性的重组AMPK蛋白复合体。根据AMPK底物乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化修饰位点(Ser79)设计合成生物素标记的多肽(SAMS)作为AMPK激酶的底物。在ATP存在的情况下AMPK对生物素标记的SAMS多肽进行磷酸化修饰,反应产物转移到链霉亲和素包被的酶标板中,SAMS多肽通过链霉亲和素结合到酶标板。以能够识别SAMS磷酸化修饰的抗体作为一抗进行ELISA检测,SAMS的磷酸化修饰水平反应AMPK的激酶活性。结果 利用大肠杆菌表达系统成功得到有激酶活性的AMPK蛋白复合体,建立了ELISA检测AMPK的激酶活性方法。通过对AMPK激活剂A-769662检测,证明该方法可以用于AMPK激活剂/抑制剂的筛选。结论 通过构建大肠杆菌共表达系统,成功获得了AMPK激酶,与传统方法相比更为简洁高效;建立的AMPK的激酶活性检测方法操作简单、准确度高且安全高效,有望用于海洋活性分子的大规模筛选,加快我国“蓝色药库”的开发。

主 题 词：AMPK 活性检测 酶联免疫吸附法 

学科分类：1007[医学-药学类] 1006[医学-中西医结合类] 100706[100706] 100602[100602] 10[医学] 

D　O　I：10.13400/j.cnki.cjmd.2022.02.006

馆 藏 号：203111598...