环形泰勒虫重组TA04380蛋白的原核表达及ELISA的建立

作     者：曹天行 刘军龙 张志刚 史康妍 石苗 关贵全 李有全 殷宏 罗建勋 CAO Tian-xing;LIU Jun-long;ZHANG Zhi-gang;SHI Kang-yan;SHI Miao;GUAN Gui-quan;LI You-quan;YIN Hong;LUO Jian-xun

作者机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 

基　　金：国家自然科学基金(31972706) 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2022年第40卷第3期

页      码：362-368页

摘      要：目的 表达环形泰勒虫的重组TA04380蛋白(r TA04380)并建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,初步评价该方法的应用价值。方法 用TMHMM和SignalP对TA04380蛋白进行生物信息学分析,根据GenBank上公布的环形泰勒虫TA04380核苷酸序列设计引物,PCR扩增TA04380基因的截短片段(1~636 bp),构建pET30a (+)-TA04380表达质粒,转化至Rosetta (DE3)感受态细胞,诱导表达并纯化r TA04380蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达情况;蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析r TA04380蛋白的反应原性及其与其他牛梨形虫的交叉反应性。以r TA04380蛋白为靶抗原建立检测抗环形泰勒虫抗体的ELISA方法,筛选确定最佳的抗原包被量、血清和二抗的稀释度、孵育时间以及最优的封闭剂;用所建立的ELISA方法检测56份标准环形泰勒虫阴性牛血清和76份标准环形泰勒虫阳性牛血清以确定该检测方法的阈值;分析r TA04380蛋白包被后第1、 2、 3周ELISA方法的重复性和稳定性;用建立的ELISA检测125份牛血清,并与已报道的基于子孢子表面抗原(SPAG)蛋白的ELISA方法作比较,计算符合率;用建立的ELISA方法检测571份来自9个省(自治区)的牛血清,评价该方法的应用价值。结果生物信息学分析结果显示,环形泰勒虫TA04380蛋白无信号肽序列,在212~413 aa存在4次跨膜区,与东方泰勒虫同源蛋白的氨基酸序列一致性为55%;PCR扩增片段长636 bp。SDS-PAGE结果显示,r TA04380蛋白主要以包涵体的形式存在,纯化后的r TA04380蛋白相对分子质量(Mr)为31 940;Western blotting分析结果显示,r TA04380蛋白能与抗His的单克隆抗体和环形泰勒虫阳性牛血清反应,与东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫阳性牛血清和健康牛血清无交叉反应。以r TA04380蛋白为抗原建立的ELISA方法,最佳反应条件为:抗原包被浓度为10μg/ml,1%牛血清白蛋白封闭1 h,1∶100稀释的血清孵育1 h,1∶6 000稀释的兔抗牛HRP-IgG孵育1 h;检测阈值为16.9%,敏感性和特异性分别为93.4%和96.4%,假阳性率为3.6%。用所建立的ELISA方法与基于SPAG蛋白的ELISA方法检测牛血清样品的阳性率分别是54.4%(68/125)和49.6%(62/125),符合率为85.6%。用所建立的ELISA方法检测来自9个省(自治区)的571份牛血清样品,总阳性率为43.1%(246/571),其中阳性率由高到低依次为吉林(85.7%,24/28)、宁夏(54.2%,13/24)、贵州(50.0%,13/26)、河南(8/16)、甘肃(43.8%,57/130)、内蒙古(42.2%,35/83)、辽宁(41.1%,30/73)、云南(38.2%,42/110)和青海(29.6%,24/81)。结论 成功表达了r TA04380蛋白,建立的ELISA方法敏感性、特异性高,稳定性和符合性良好,具有大规模现场应用的潜在价值。

主 题 词：环形泰勒虫 TA04380蛋白 原核表达 特异性 ELISA方法 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.12140/j.issn.1000-7423.2022.03.013

馆 藏 号：203112903...