人鞘磷脂合酶干扰载体的构建与鉴定

作     者：胡时栋 丁毅 宋丹丹 陈清兰 颜念龙 HU Shi-dong;DING Yi;SONG Dan-dan;CHEN Qing-lan;YAN Nian-long

作者机构：南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室南昌330006 

基　　金：南昌大学2012年本科创新实验项目(2012184)~~ 

出 版 物：《复旦学报（医学版）》 (Fudan University Journal of Medical Sciences)

年 卷 期：2013年第40卷第5期

页      码：584-588页

摘      要：目的构建沉默人鞘磷脂合酶1(SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础。方法根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成用于构建人SMS沉默载体的DNA寡核苷酸,应用基因重组技术分别和线性化pSUPER干扰载体连接,构建了pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2重组干扰载体,并用EcoRI和HindIII限制性内切酶同时处理重组载体pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2,随后测序,以鉴定重组干扰载体含有目的序列。同时为检测重组干扰载体对人SMS1和SMS2基因的干扰效率,本研究利用脂质体(Lipofectamine 2000)分别转染肝癌细胞HepG2,于48h后分别检测HepG2细胞SMS1和SMS2mRNA的转录水平与SMS酶活(薄层层析法,TLC)。结果所筛选到的重组质粒pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后获得了281bp DNA片段,且测序结果和理论设计的DNA寡核苷酸一致;随后检测转染HepG2细胞后SMS1和SMS2的mRNA表达水平。实验结果显示SMS1和SMS2的表达分别下降了45%和67%(P<0.001,n=3),而TLC法的酶活结果检测显示,SMS1和SMS2干扰后的SMS酶活均有显著下降,分别下降了56%和63%(P<0.001,n=3)。结论成功构建了人SMS1以及SMS2基因的沉默载体即pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2。

主 题 词：鞘磷脂合酶 pSUPER干扰质粒 HepG2细胞 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 071010[071010] 1002[医学-临床医学类] 081704[081704] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-轻工类] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1672-8467.2013.05.015

馆 藏 号：203113486...