新型阿卡斑病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

作     者：马玲 孟菲 陆晨阳 陈赫威 蔡畅 秦树英 覃绍敏 刘金凤 陈凤莲 吴健敏 MA Ling;MENG Fei;LU Chen-yang;CHEN He-wei;CAI Chang;QIN Shu-ying;QIN Shao-min;LIU Jin-feng;CHEN Feng-lian;WU Jian-min

作者机构：广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001 

基　　金：国家自然科学基金项目(31260830) 广西兽医生物技术重点实验室开放基金项目(20-065-23-B-2) 广西兽医研究所基本科研业务费专项(桂科专项21-7) 

出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)

年 卷 期：2022年第53卷第6期

页      码：1734-1741页

摘      要：【目的】建立检测新型阿卡斑病毒(AKAV)的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR,并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查,了解其流行趋势及遗传进化特征,为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。【方法】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR并通过Ct值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应体系及扩增程序;以优化的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测2019年6-10月在广西边境地区采集的139份蚊样品,获得的新型AKAV经测序后采用ClustalW构建遗传进化树。【结果】SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR最佳反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μL,上、下游引物(4μmol/L)各1.0μL,标准品或反转录产物2.0μL,双蒸水补齐至20.0μL。扩增程序:95℃预变性30 s;95℃30 s,64℃(S基因)/66℃(M基因)30 s,72℃30 s,进行40个循环。SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的极限为1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%,但不能扩增蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌;检测S基因和M基因的批内重复试验、批间重复试验变异系数(CV)均低于5.00%。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV,且均属于基因Ia型,尤其与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性。【结论】针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外,从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV,属于基因Ia型,与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性,推测新型AKAV已在广西周边省份流行。

主 题 词：新型阿卡斑病毒(AKAV) 蚊媒病毒 SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR 广西边境地区 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.06.027

馆 藏 号：203114393...