T-ARMS PCR多重检测方法研究

作     者：陶明丽 李莹雪 李豪 张威 李传宇 周连群 李金泽 TAO Mingli;LI Yingxue;LI Hao;ZHANG Wei;LI Chuanyu;ZHOU Lianqun;LI Jinze

作者机构：中国科学技术大学生命科学与医学部生物医学工程学院(苏州)江苏苏州215123 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏苏州215163 

基　　金：国家自然科学基金项目(61874133,61901469,22005331) 江苏省科技项目(BE2019684,BE2020768) 江苏省苏州市基础研究试点项目(SJC2021019) 

出 版 物：《国际检验医学杂志》 (International Journal of Laboratory Medicine)

年 卷 期：2022年第43卷第22期

页      码：2689-2694页

摘      要：目的 建立有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(T-ARMS PCR)多重检测的方法,实现针对肝细胞癌常见基因突变位点TP53 R249S、TP53 R273H、CTNNB1 S45F的多重检测。方法 针对3个基因突变位点进行引物设计,每个基因突变位点所设计引物序列的5′端不加一段DNA序列(Tail Free Primer)或者所设计的引物序列5′端加一段相同的DNA序列(Tailed Primer),利用实时荧光定量PCR仪分别检测并比较3个基因突变位点的不同引物序列形成的单重体系、三重体系的扩增结果,研究T-AMRS PCR方法对突变型基因位点突变负荷的检测限、特异性和多靶标检测能力。结果 3个基因突变位点Tailed Primer单重体系扩增结果显示,突变型质粒的扩增均优于野生型质粒,野生型质粒的扩增均被有效抑制,突变负荷检测限低至0.10%,特异性良好。Tailed Primer三重体系减少了引物二聚体的产生,调控CTNNB1 S45F、TP53 R249S、TP53 R273H的解链温度分别为81.11℃、82.36℃、86.35℃,实现不同突变位点的显著区分。与Taqman探针基因分型方法相比,T-AMRS PCR方法野生型和突变型基因的Ct值差异更显著,单荧光通道即可实现突变基因检测。结论 运用T-ARMS PCR进行一管三重检测,分析熔解曲线,能有效检测到目的基因突变,抑制野生型模板的扩增,并区分不同的基因突变位点;同时,Tailed Primer设计减少了多重情况下引物二聚体的产生。该方法可为临床中肝细胞癌的早期筛查、预后预测、病情监测提供理论依据。

主 题 词：有错配的加尾双引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应 多重检测 熔解曲线分析 基因突变 肝细胞癌 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100206[100206] 10[医学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1673-4130.2022.22.001

馆 藏 号：203115510...