沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响

作     者：张艺 吴道秋 汤弘婷 李梦醒 刘虹麟 陈忠良 李琴山 Zhang Yi;Wu Daoqiu;Tang Hongting;Li Mengxing;Liu Honglin;Chen Zhongliang;Li Qinshan

作者机构：贵州医科大学医学检验学院临床生物化学教研室贵州省贵阳市550004 贵州医科大学附属医院血液科贵州省贵阳市550004 北京中日友好医院临床医学研究所北京市100000 贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州省贵阳市550004 贵州医科大学附属医院贵州省产前诊断中心贵州省贵阳市550004 

基　　金：国家自然科学基金(81960476,81460365),项目负责人:李琴山 国家自然科学基金(81760039),项目负责人:李梦醒 国家自然科学基金(81402451,82173378),项目负责人:刘虹麟 贵州省科技厅资助项目(1270),项目负责人:李琴山 贵州省科技厅资助项目(4Y160),项目负责人:李梦醒 贵州省卫生健康委基金(gzwkj2021-160),项目负责人:李梦醒 

出 版 物：《中国组织工程研究》 (Chinese Journal of Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2023年第27卷第24期

页      码：3838-3844页

摘      要：背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。

主 题 词：MKRN1基因 四环素诱导调控表达系统 基因表达调控 慢病毒 

学科分类：0831[工学-公安技术类] 1002[医学-临床医学类] 08[工学] 1010[医学-医学技术类] 0836[0836] 100215[100215] 10[医学] 

D　O　I：10.12307/2023.165

馆 藏 号：203116195...