定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6与醛缩酶的作用位点

作     者：郑斌 尹志奎 詹希美 ZHENG Bin;YIN Zhi-kui;ZHAN Xi-mei

作者机构：河南省新乡医学院寄生虫学教研室新乡453003 河南省新乡医学院药理学教研室新乡4530032 中山大学中山医学院寄生虫学教研室广州510089 

基　　金：河南省科技攻关计划项目(No.112102310209) 河南省教育厅自然科学研究项目(No.2012B310019) 新乡医学院博士科研启动基金(2010)~~ 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2014年第32卷第3期

页      码：221-224页

摘      要：目的利用定点突变技术鉴定弓形虫微线体蛋白6(MIC6)与醛缩酶的作用位点。方法根据GenBank中的弓形虫RH株MIC6基因序列(登录号为AF110270)及C端序列设计特异性引物,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)348位色氨酸(W348)的密码子碱基突变为缬氨酸(V)的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3);0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-MIC6C W/V突变体蛋白,亲和层析法纯化表达产物。以GST-MIC6C W/V突变体蛋白为探针蛋白,GST-MIC6C蛋白为对照蛋白,分别与弓形虫速殖子裂解液进行GST沉降实验,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析实验产物。分别以GST-MIC6C W/V突变体蛋白和GST-MIC6C蛋白为探针蛋白和对照蛋白,与弓形虫醛缩酶蛋白液进行GST沉降实验,SDS-PAGE分析实验产物。结果获得了MIC6C W/V突变体基因片段,构建了相应的原核表达载体,表达并纯化了GST-MIC6C W/V突变体蛋白。GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫速殖子裂解液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体特异识别;GST-MIC6C W/V突变体蛋白与弓形虫醛缩酶蛋白液的GST沉降产物中未见蛋白条带,而GST-MIC6C蛋白的沉降产物中可见一蛋白条带。结论色氨酸(W348)为MIC6与醛缩酶的作用位点。

主 题 词：刚地弓形虫 微线体蛋白6 醛缩酶 定点突变技术 蛋白作用位点 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

馆 藏 号：203119884...