shRNA／mrp1表达载体构建及其体外表达研究

作     者：潘光栋 严律南 杨建青 褚光平 刘强 肖亿 PAN Guang-dong;YAN Lü-nan;YANG Jian-qing;CHU Guang-ping;LIU Qiang;XIAO Yi

作者机构：广西医科大学第五附属医院柳州市人民医院柳州545001 四川大学华西医院成都610041 

基　　金：本课题受国家自然科学基金资助(基金编号30170925)及广西科学基金资助(基金编号桂科青0728102) 

出 版 物：《中华肝胆外科杂志》 (Chinese Journal of Hepatobiliary Surgery)

年 卷 期：2010年第16卷第1期

页      码：48-53页

摘      要：目的构建shRNA／mrp1的质粒表达载体并验证其体外表达效率。方法根据业已筛选出的mrp1基因RNAi靶序列，按照pSUPER的设计要求合成64bp的寡核苷酸序列，将其退火后形成双链并用双酶切法克隆到pSUPER得到质粒pSUPER-shRNA／mrp1，转染感受态大肠杆菌，筛选阳性克隆，经测序证实后扩增培养并以去内毒素试剂盒提取，然后转染HepG2／mrp1细胞，阴性载体为对照组，Real—time PCR、流式细胞术检测mrp1基因mRNA、MRP1表达、细胞耐药性等功能变化。结果成功构建质粒载体pSUPER—shRNA／mrp1，经基因测序证实靶序列插入正确；HepG2／mrp1组Ct值较GAPDH增加5．61，HepG2／mrp1—si组Ct值比GAPDH升高11．35，mrp1基因的表达水平是耐药株HepG2／mrp1的179分之一；实验组HepG2／mrp1细胞和阴性对照组HepG2／mrp1细胞的MRP表达率分别为11．2％和97．6％，差别有统计学意义（P〈0．05）；药物敏感试验显示HepG2／mrp1细胞耐药倍数从45．0下降到1．2，相对逆转效率99．62％；细胞内DNR累积量也明显增加，与对照组比较（78．58％vs38．44％，P〈0．05）。结论成功构建质粒载体pSUPER-shRNA／mrp1，在HepG2／mrp1内稳定表达，逆转其耐药性。

主 题 词：基因表达 多药耐药 构建 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1007-8118.2010.01.016

馆 藏 号：203121005...