靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞制备及其对非小细胞肺癌的杀伤作用

作     者：闵静婷 张露 龙赤荣 樊红莲 李正红 Min Jingting;Zhang Lu;Long Chirong;Fan Honglian;Li Zhenghong

作者机构：蚌埠医学院基础医学院蚌埠233017 蚌埠医学院生命科学院蚌埠233017 

基　　金：国家自然科学基金(81472656) 安徽省重点研究与开发计划项目(201904a07020019) 蚌埠医学院研究生科研创新项目(Byycxz21019、Byycxz21054) 

出 版 物：《中华肿瘤杂志》 (Chinese Journal of Oncology)

年 卷 期：2023年第45卷第4期

页      码：322-329页

摘      要：目的:制备靶向c-Met蛋白的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T),并检测其对人非小细胞肺癌(NSCLC)H1975细胞的体外杀伤作用。方法:将含c-Met抗体scFv片段的CAR序列插入慢病毒质粒中,用酶切质粒电泳,检测目的基因正确性。质粒转染工具为HEK293细胞,收集浓缩慢病毒,通过慢病毒感染的方式制备第二代c-Met CAR-T,通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot验证CAR序列的表达,采用流式细胞术检测c-Met CAR-T的阳性率、细胞亚型,流式细胞术验证NSCLC细胞H1975中c-Met蛋白的阳性表达并选择c-Met蛋白阴性表达的卵巢癌细胞A2780作为对照,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测c-Met CAR-T在效靶比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20时对H1975细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测c-Met CAR-T在靶抗原刺激下,细胞因子白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IFN-γ的释放情况。结果:成功合成c-Met CAR慢病毒重组质粒,酶切条带位置符合理论值。基因测序结果符合原设计序列,并成功包装慢病毒。Western blot和qRT-PCR结果显示,CAR分子存在于慢病毒感染后的T细胞中,c-Met CAR-T构建成功。c-Met CAR-T阳性率可达38.4%以上,且在慢病毒感染过后CD8 + T细胞比例有所上调。流式细胞术验证结果显示,NSCLC细胞H1975有较强的c-Met蛋白表达,卵巢癌细胞A2780 c-Met蛋白表达阴性。LDH释放实验提示,c-Met CAR-T的抗肿瘤作用随效靶比的提升而增强,且均高于对照组,当效靶比为20∶1时杀伤率达到51.12%。ELISA检测结果显示,与对照组比较,在靶细胞刺激下c-Met CAR-T能释放出更多的IL-2、TNF-α和IFN-γ,而Non target组无此效应。 结论:c-Met在NSCLC细胞系H1975中表达,可以作为NSCLC免疫治疗的靶点;靶向c-Met的CAR-T能对c-Met阳性肺癌细胞产生较强的体外杀伤作用。

主 题 词：肺肿瘤 嵌合抗原受体 c-Met 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.cn112152-20211008-00745

馆 藏 号：203121239...