定向进化和半理性设计改造顺式环氧琥珀酸水解酶

作     者：王国桧 谢志鹏 张建国 WANG Guohui;XIE Zhipeng;ZHANG Jianguo

作者机构：浙江大学药物生物技术研究所&医学院浙江杭州310058 浙江省微生物生化与代谢工程重点实验室浙江杭州310058 杭州宝晶生物股份有限公司浙江杭州311106 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2023年第50卷第5期

页      码：1741-1755页

摘      要：【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid,ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活性为野生型的1.2倍。动力学分析发现,突变体L231P/N226S和T223S对底物ESH的亲和力有明显提升,Km值分别为20 mmol/L和21 mmol/L,较野生型分别降低18%和16%。分子对接研究表明,突变位点主要通过改变底物结合口袋促进酶与底物的相互作用,从而影响酶活。【结论】获得了温度和pH稳定性好、催化活性明显提高的CESH(D)突变体,初步分析突变位点影响酶活的机制,为进一步研究CESH(D)的结构-功能关系及深入改造提供指导。

主 题 词：顺式环氧琥珀酸水解酶 D(-)-酒石酸 定向进化 半理性设计 

学科分类：08[工学] 082203[082203] 0822[工学-核工程类] 

核心收录：

D　O　I：10.13344/j.microbiol.china.220653

馆 藏 号：203121730...