利用CRISPR/Cas9技术构建PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞系

作     者：张家翔 韩佃刚 师亚玲 毛晓月 赵凯薇 杜萱 信吉阁 ZHANG Jiaxiang;HAN Diangang;SHI Yaling;MAO Xiaoyue;ZHAO Kaiwei;DU Xuan;XIN Jige

作者机构：云南农业大学动物医学院昆明650201 昆明海关技术中心昆明650200 

基　　金：国家自然科学基金项目(31960658、31360532) 云南省自然科学基金项目(2013FB041) 兴滇英才支持计划“青年人才”专项(YNWR-QNBJ-2020-154) 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2023年第50卷第7期

页      码：2670-2677页

摘      要：【目的】利用CRISPR/Cas9技术敲除猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因,进而在细胞水平上研究PPARγ基因与肠道炎症反应相关的生物学机制。【方法】根据猪PPARγ基因序列(GenBank登录号:NM_214379),在第2外显子区域设计2对sgRNA序列,经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1;将构建成功的PPARγ正向打靶载体、反向打靶载体、Cas9-nickase质粒共转染至IPEC-J2细胞,经G418药物筛选获得单克隆细胞株,提取单克隆细胞株DNA后进行PCR扩增,经凝胶电泳鉴定后送测序;挑选基因敲除效果最佳的细胞株,利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况。【结果】打靶载体测序结果显示,打靶序列正确连接;经转染、筛选后共获得48株单克隆细胞;测序结果显示,6株单克隆细胞出现双峰,分别为KO-15、KO-17、KO-21、KO-25、KO-32和KO-35;选择底峰较高的KO-25进行免疫荧光检测,结果显示PPARγ蛋白表达降低。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞,为后续进一步研究PPARγ基因在炎症反应中的功能奠定了基础。

主 题 词：CRISPR/Cas9 过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ) IPEC-J2细胞 基因敲除 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.16431/j.cnki.1671-7236.2023.07.008

馆 藏 号：203122442...