利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

作     者：张佳慧 阎晗 胡德庆 ZHANG Jia-hui;YAN Han;HU De-qing

作者机构：天津医科大学基础医学院细胞生物学系天津300070 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(31872825) 

出 版 物：《天津医科大学学报》 (Journal of Tianjin Medical University)

年 卷 期：2023年第29卷第4期

页      码：372-378页

摘      要：目的:利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10),自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法:设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中,并利用抗性筛选出单克隆细胞,进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果:通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系,其Aff4基因mRNA水平(t=53.08,P<0.001)和AFF4蛋白表达水平(t=15.17,P<0.001)显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好(t=264.7,P<0.0001)。结论:成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系,并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。

主 题 词：AFF4 CRISPR/Cas9 表观遗传 原核表达 多克隆抗体 

学科分类：1001[医学-基础医学] 10[医学] 

馆 藏 号：203122518...