靶向preC／C基因特异性RNA干扰对乙型肝炎病毒在肝癌细胞系中复制与表达的影响

作     者：边中启 刘霜 刘明秋 肖安 焦晔 严维耀 郑兆鑫 刘雪松（编辑） BIAN Zhong-qi;LIU Shuang;LIU Ming-qiu;XIAO An;JIAO Ye;YAN Wei-yao;ZHENG Zhao-xin

作者机构：解放军成都军区昆明总医院传染病中心昆明650032 复旦大学遗传所昆明650032 

基　　金：国家自然科学基金(30972629) 

出 版 物：《中华医学杂志》 (National Medical Journal of China)

年 卷 期：2012年第92卷第11期

页      码：768-772页

摘      要：目的探讨靶向乙型肝炎病毒（HBV）preC／C基因的小干扰RNA（siRNA）在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2．2．15细胞中抗病毒基因治疗效果。方法根据GenBank中HBV（GenBank登录号U95551）基因组序列，设计合成靶向HBVpreC／C基因的3个长2l核苷酸（nt）的siRNA，设计1个对照的非同源长2Int的siRNA，分别克隆到pU6质粒中，构建3个shRNA表达载体pU6-C1，pU6-C2，pU6-C3和对照pU6-C4；为了检测siRNA功能建立报告基因系统，以pT-HBVl．3为模板，PCR合成目的基因preC／C，克隆到绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体（pEGFP-N1）中构建携带EGFP报告基因的重组质粒***／C（E-C）。将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞，或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2．2．15细胞。首先，在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数，评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应；接着在HepG2．2．15细胞中，运用ELISA检测转染后24、48、72和96h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR（real-timePCR）进一步检测HBVmRNA转录产物cDNA的拷贝变化。结果发现siRNA表达质粒与E．C共转染Huh-7细胞后48h，与pEGFP-N1单质粒转染相比，pU6-C1，pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低了80％，而对照pU6-CA或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达，差异有统计学意义（P〈0．01）；免疫荧光技术检测发现HepG2．2．15细胞内HBsAg和HBcAg表达显著降低，real-timePCR发现pU6．C1、pU6-C2或pU6．C3共转染HepG2．2．15细胞后48h，使mRNA转录产物的cDNA含量分别降低了73．9％±1，2％（P=0．029）、48．2％±1．8％和35．8％±1．4％（P：0．037，0．040），而不论pU6-CA或pU6对照共转染组均不能降低cDNA含量，差异均有统计学意义（均P〈0．01）；pU6-C1结果与显微镜观察／流式细胞仪细胞计数、ELISA和免疫荧光技术检测结果相吻合。抗病毒效果48h后作用明显，72h达到高峰。结论靶向preC／C基因的RNAi能够有效特异抗HBV在人类肝癌细胞系中的复制与表达。RNAi可能成为抗重大传染病HBV／HCV／HIV有效的基因治疗技术。

主 题 词：肝炎病毒 乙型 RNA干扰 基因疗法 

学科分类：1004[医学-公共卫生预防医学类] 1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 100401[100401] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2012.11.013

馆 藏 号：203122641...