白纹伊蚊唾液蛋白Alb-AG5-3的基因特征分析及真核表达

作     者：高敏 吴家红 程金芝 张霞 牟小会 聂映 彭哲慧 李志强 赵久刚 商正玲 刘磊 蓝静 刘红美 GAO Min;WU Jiahong;CHENG Jinzhi;ZHANG Xia;MU Xiaohui;NIE Ying;PENG Zhehui;LI Zhiqing;ZHAO Jiugang;SHANG Zhengling;LIU Lei;LAN Jing;LIU Hongmei

作者机构：贵州医科大学生物与工程学院/健康医药现代产业学院生物技术教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室 贵州医科大学基础医学院免疫学教研室 

基　　金：国家自然科学基金项目(No.32160185 81971972) 贵州省科学技术基金项目[黔科合基础-ZK(2021)一般481 黔科合基础ZK(2022)一般366] 

出 版 物：《中国病原生物学杂志》 (Journal of Pathogen Biology)

年 卷 期：2023年第18卷第9期

页      码：1039-1046页

摘      要：目的 初探白纹伊蚊唾液蛋白Antigen5-3(Alb-AG5-3)的结构与功能特征,并采用果蝇S2真核表达体系表达Alb-AG5-3。方法 采取同源比对的方式,从NCBI数据库中钓取Antigen5-3序列,根据白纹伊蚊分泌蛋白Antigen5-3基因参考序列(GenBank:AY826105.1)设计特异性引物,从白纹伊蚊安顺株中扩增基因全长。经序列比对后利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expasy)以及生物信息学在线软件SignalP、TMHMM、SOPMA、SWISS-MODEL、AlphaFold等对该蛋白进行生物信息学分析。Trizol法提取白纹伊蚊雌蚊与雄蚊整蚊以及吸血前后雌蚊唾液腺RNA,qRT-PCR检测Alb-AG5-3在RNA相对表达量;以白纹伊蚊整蚊cDNA为模板,特异性扩增除信号肽外的Alb-AG5-3编码区,PCR产物经切胶回收纯化后与昆虫真核表达载体pMT/BiP/V5连接,构建真核重组质粒pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3。随后转入果蝇S2细胞中,500μmol/L CuSO4诱导重组蛋白Alb-AG5-3的表达。收集上清,采用Western blot鉴定V5表达标签,镍柱亲和层析纯化重组蛋白Alb-AG5-3。结果 生物信息学分析该基因CDS(Coding sequence)区扩增全长为768 bp,编码255个氨基酸,二、三级结构预测以无规则卷曲和a-螺旋为主,具CAP超家族经典的PR-1结构域,该基因编码的蛋白是一种强亲水性(GRAVY:-0.864)的富含半胱氨酸的分泌蛋白。Alb-AG5-3 mRNA在雌蚊中表达量高于雄蚊且吸血后的表达量显著下调。成功构建了白纹伊蚊唾液蛋白pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3真核表达质粒并通过果蝇S2表达体系表达出真核蛋白,镍柱亲和纯化后的Alb-AG5-3经Western blot检测能被V5标签蛋白抗体识别。结论 成功构建白纹伊蚊Alb-AG5-3真核质粒并在果蝇S2细胞中表达真核蛋白Alb-AG5-3,镍柱亲和纯化后获得单一的Alb-AG5-3蛋白以备后续分析。

主 题 词：白纹伊蚊 唾液腺 Alb-AG5-3蛋白 真核表达 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13350/j.cjpb.230909

馆 藏 号：203122827...