兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立

作     者：张贺 陶坤盛 陈见兴 王豪杰 陈洪岩 王玉娥 夏长友 ZHANG He;TAO Kunsheng;CHEN Jianxing;WANG Haojie;CHEN Hongyan;WANG Yu’e;XIA Changyou

作者机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队哈尔滨150069 

基　　金：国家重点研发计划青年科学家项目(2021YFF0703100) 高等级农业实验动物猪培育、质量控制及检测技术(GZ20210010) 实验动物资源培育及检测质量提升研究(1610302022018) 实验猪质量控制及其抗病性遗传基础研究(SKLVBP202120) 实验猪质量控制及其抗病性遗传基础研究(SKLVBP202101) 

出 版 物：《实验动物科学》 (Laboratory Animal Science)

年 卷 期：2023年第40卷第4期

页      码：10-16页

摘      要：目的建立兔源多杀性巴氏杆菌(Pm)、金黄色葡萄球菌(Sa)和肺炎克雷伯菌(Kp)的多重PCR方法。方法本研究参考Pm kmt1基因、Sa nuc基因和Kp kh1基因的保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm),采用控制单一变量法优化引物浓度,构建kmt1、nuc和kh1基因的重组质粒标准品pMDPm、pMD-Sa和pMD-Kp,确定最小检测量;以兔源支气管败血波氏杆菌和产气荚膜梭菌等9种病原体核酸样本确定多重PCR法的特异性;通过批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。结果最适退火温度为54.5℃;扩增kmt1和nuc基因的引物最适浓度均为1μL(10μmol/L),扩增kh1基因的引物最适浓度为0.5μL(10μmol/L);pMD-Pm最低检测限为20.6 copies/μL,pMDSa最低检测限为18.2 copies/μL,pMD-Kp最低检测限为23.2 copies/μL,表明其灵敏性高;该方法仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增条带,对其他病原体均无扩增条带,表明特异性较强;批间和批内检测结果一致,表明重复性较好;经临床样本检测Pm、Sa和Kp单独的阳性率分别为62.92%、25.84%和49.43%,与已报道的检测方法结果一致。结论本研究成功建立了一种能够同时快速检测兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR方法。

主 题 词：多杀性巴氏杆菌 金黄色葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 多重PCR 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071002[071002] 

D　O　I：10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.003

馆 藏 号：203123089...