CRISPR/dCas9-KRAB系统沉默猪LncRNA-NEAT1基因

作     者：赵为民 戴超辉 陈哲 涂枫 李辉 付言峰 李碧侠 任守文 程金花 ZHAO Wei-min;DAI Chao-hui;CHEN Zhe;TU Feng;LI Hui;FU Yan-feng;LI Bi-xia;REN Shou-wen;CHENG Jin-hua

作者机构：江苏省农业科学院畜牧研究所江苏南京210014 江苏省农业种质资源保护与利用平台江苏南京210014 农业农村部种养结合重点实验室江苏南京210014 

基　　金：江苏省种业振兴揭榜挂帅项目[JBGS(2021)099] 扬州市重点研发项目(现代农业)(YZ2021037) 国家生猪产业技术体系项目(CARS-PIG-35) 江苏省农业重大新品种创制项目(PZCZ201733) 

出 版 物：《江苏农业学报》 (Jiangsu Journal of Agricultural Sciences)

年 卷 期：2023年第39卷第4期

页      码：1036-1042页

摘      要：本研究利用RT-PCR检测LncRNA-NEAT1基因表达在细胞中的亚定位,采用5′RACE获得LncRNA-NEAT1基因的转录起始位点;利用CRISPOR软件对-300~0 bp区域的LncRNA-NEAT1启动子序列设计sgRNA并构建到px330载体,通过转染细胞与T7E1酶切验证sgRNA效率;利用酶切和亚克隆方法将dCas9-KRAB-BSD片段替换px330载体的Cas9序列,形成重组px330-dCas9-KRAB载体;将验证有效的sgRNA构建到px330-dCas9-KRAB载体,形成px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体。添加不同质量浓度的Blasticidin S处理细胞,以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度。转染px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体并用Blasticidin S筛选细胞7 d后进行LncRNA-NEAT1基因的表达检测,同时对sgRNA在LncRNA-NEAT1基因启动子上的结合位点进行Sanger测序,以进一步验证上述结合位点是否发生切割。结果显示LncRNA-NEAT1主要表达于细胞核,而在细胞质中几乎不表达。5′RACE获得了LncRNA-NEAT15′端大约270 bp的序列。qPCR检测结果显示,与对照组相比,sgRNA1和sgRNA2能够显著抑制LncRNA-NEAT1的表达(P<0.05)。Sanger测序结果表明sgRNA1和sgRNA2所在的位点并没有发生碱基缺失和插入。研究结果为后续进一步研究LncRNA-NEAT1在先天性免疫反应中的功能奠定了基础。

主 题 词：CRISPR dCas9-KRAB LncRNA-NEAT1基因 猪 基因沉默 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

核心收录：

D　O　I：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.04.013

馆 藏 号：203123436...