靶向人转录因子GLI1基因的RNAi真核表达载体的构建与鉴定

作     者：郭杰芳 高军 龚燕芳 金晶 吴红玉 满晓华 李兆申 GUO Jie-fang;GAO Jun;GONG Yan-fang;JIN Jing;WU Hong-yu;MAN Xiao-hua;LI Zhao-shen

作者机构：第二军医大学长海医院消化内科上海200433 

基　　金：国家自然科学基金(81101575) 上海市科委医学引导类项目(114119a6700) 

出 版 物：《中华胰腺病杂志》 (Chinese Journal of Pancreatology)

年 卷 期：2013年第13卷第2期

页      码：118-121页

摘      要：目的利用pGCsi—U6-GFP质粒构建干扰人转录因子GLI1基因的小发夹RNA（shRNA）表达载体，并进行干扰活性鉴定。方法根据GenBank中GLI1cDNA的序列，设计并合成3条GLI1siRNA，分别克隆至质粒载体pGCsi-U6-GFP中构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，扩增后提取质粒，行PCR及测序鉴定。脂质体转染法将鉴定正确的3个重组质粒pGCsi—U6-GLI1siRNA-1、pGCsi—U6-GHlsiRNA4、pGCsi—U6-GLI1siRNA-3及作为阴性对照质粒的pGCsi—U6-GLI1siRNA—C分别与过表达质粒pEGFP—N1-GLI1共转染HEK293细胞株，48h后收集细胞，半定量RT—PCR及蛋白质印迹法检测各组细胞GLI1mRNA及蛋白的表达，鉴定筛选出最佳干扰质粒。结果3个重组质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi—U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3均扩增出预期大小（369bp）的片段，经测序证实与设计合成的序列完全一致。3个重组质粒转染HEK29细胞后细胞GLI1mRNA表达量分别为0．290±0．011、0．421±0．018、0．373±0．018，蛋白表达量分别为0．318±0．026、0．433±0．021、0．381±0．018，均显著低于阴性对照质粒转染细胞的0．834±0．022及0．818±0．024（P=0．000）。GLI1mRNA表达抑制率分别达65．8％、50．7％、55．7％，蛋白表达抑制率分别为63．9％、48．3％、53．9％，以pGCsi-U6-GLI1siRNA．1的干扰作用最强。结论成功构建了靶向GLI1的shRNA表达载体，筛选出具有最佳干扰效果的质粒，为进一步研究GLI1基因功能奠定了基础。

主 题 词：RNA干扰 shRNA 转录因子 GLI1基因 Hedgehog信号通路 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 09[农学] 

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.011

馆 藏 号：203124221...