一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立

作     者：李新艳 陈良 马张妹 毛日成 黄玉仙 张继明 Li Xinyan;Chen Liang;Ma Zhangmei;Mao Richeng;Huang Yuxian;Zhang Jiming

作者机构：上海市公共卫生临床中心肝病科201508 复旦大学上海医学院教育部、卫生部医学分子病毒学重点实验室 复旦大学附属华山医院感染科 

基　　金：上海市卫生局课题资助项目(20124466) 

出 版 物：《中华传染病杂志》 (Chinese Journal of Infectious Diseases)

年 卷 期：2014年第32卷第5期

页      码：257-262页

摘      要：目的 建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法 首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV DNA,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）,继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定（LAM）耐药变异株和阿德福韦酯（ADV）耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634（LAM耐药）及RT6923（ADV耐药）.分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVDNA水平.结果 成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV DNA均＞1＆#215;107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型（HBsAg的表达及HBV DNA的复制）.在PHY634及RT634转染实验中,HBV DNA水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度（IC50）＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV DNA对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207（1.2 μmol/L）.结论 本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.

主 题 词：肝炎病毒,乙型 RNA指导的DNA聚合酶 抗药性 表型 

学科分类：1007[医学-药学类] 100705[100705] 1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2014.05.001

馆 藏 号：203124269...