永生化人巩膜成纤维细胞系建立的研究

作     者：李佳颖 李芃 程祯 王文斌 李仕明 田佳鑫 齐越 钱俞羊 刘子涵 王宁利 Li Jiaying;Li Peng;Cheng Zhen;Wang Wenbin;Li Shiming;Tian Jiaxin;Qi Yue;Qian Yuyang;Liu Zihan;Wang Ningli

作者机构：首都医科大学附属北京同仁医院、北京同仁眼科中心、北京市眼科研究所眼科学与视觉科学北京市重点实验室100730 南开大学生命科学学院300071 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(82071000) 

出 版 物：《眼科》 (Ophthalmology in China)

年 卷 期：2023年第32卷第5期

页      码：387-391页

摘      要：目的建立永生化的人巩膜成纤维细胞系,并利用转录组测序分析永生化的影响。设计实验研究。研究对象实验组为永生化人巩膜成纤维细胞,对照组为原代人巩膜成纤维细胞。方法采用携带SV40 T基因质粒及lenti-Mix慢病毒包装质粒,利用磷酸钙转染法转染HEK293T获得慢病毒颗粒。用获得的慢病毒颗粒转染原代细胞,暴露于含有1μg/ml嘌呤霉素中2天,存活的细胞继续在培养基中体外培养至25代,获得永生化的人巩膜成纤维细胞系。之后,对永生化前后的细胞进行RNA提取及测序,分析永生化细胞与原代细胞转录本特性。使用DESeq包分析差异基因,并使用Clusterprofiler进行基因本体(GO)分析。主要指标细胞形态、胶原蛋白相关基因表达量和转录本相关性。结果永生化人巩膜成纤维细胞保持了原代细胞的形态,并呈现显著增强的增生能力,成功培养20代以上。永生化细胞与原代细胞的转录组高度相似,RNA测序显示两者相关性为r2=0.995。基于DESeq包的差异基因分析显示转录本共比对出22930个基因及33691个异构体,其中有2063(3.6%)个基因的表达呈上调趋势,2776(4.9%)个基因的表达呈下调趋势。GO功能分析结果显示,上调的基因主要聚集在DNA复制、细胞分裂等细胞基础代谢活动及与病毒的相互作用,下调的基因主要富集于细胞外基质调节与细胞间连接等通路。细胞外基质相关基因通路中,编码胶原蛋白、纤维蛋白基因转录略微下调(log2倍数变化=-0.4~-3.1),COL1A1转录量下调3.34倍。结论本研究中利用慢病毒转染法通过导入SV40T外源基因的方式构建了永生化的人巩膜成纤维细胞系,与原代细胞相似性高,稳定性好,可为巩膜相关实验提供充足的研究材料。

主 题 词：巩膜 成纤维细胞 永生化 转录组 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.13281/j.cnki.issn.1004-4469.2023.05.005

馆 藏 号：203124279...