猪SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建及鉴定

作     者：胡荣斌 洪兴 潘志洪 吴兴凤 李莉 何逸懿 徐娥 HU Rong-bin;HONG Xing;PAN Zhi-hong;WU Xing-feng;LI Li;HE Yi-yi;XU E

作者机构：贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州大学动物营养与饲料研究所贵州贵阳550025 

基　　金：国家自然科学基金项目(31860648) 

出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)

年 卷 期：2023年第54卷第7期

页      码：2146-2154页

摘      要：【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信息学分析的基础上,根据GenBank中猪SBP1基因mRNA序列(XM_021089863.1)PCR扩增SBP1基因全长序列,克隆至过表达慢病毒载体pHBLV-CMV上构建SBP1基因过表达重组慢病毒载体;同时针对猪SBP1基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,分别克隆至干扰慢病毒载体pHBLV-U6上构建SBP1基因干扰重组慢病毒载体。以构建的重组慢病毒载体感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测SBP1基因及其蛋白的表达情况。【结果】猪SBP1蛋白分子式为C_(2523)H_(3916)N_(678)O_(727)S_(24),相对分子量为56.14839 kD,理论等电点(pI)为6.40,为稳定的分泌蛋白;存在39个潜在磷酸化位点,包括20个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点及13个苏氨酸磷酸化位点。以构建的SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体分别感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选2代后,在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光。实时荧光定量PCR检测结果表明,过表达组的SBP1基因相对表达量极显著上调32.0倍(P<0.01,下同),干扰组中以shRNA-3的沉默效果达极显著水平,对应的SBP1基因相对表达量下调58.45%;Western blotting检测结果显示,过表达组的SBP1蛋白表达量极显著上调,而shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3干扰组的SBP1蛋白表达量均极显著下调。【结论】基于猪骨骼肌卫星细胞成功构建了猪SBP1基因过表达稳定表达细胞系,同时鉴定出shRNA-3对SBP1基因的沉默效果最佳并获得稳定沉默细胞系,为后续揭示SBP1基因调控猪肉品质的分子机理打下了基础。

主 题 词：猪 SBP1基因 骨骼肌卫星细胞 过表达 干扰 重组慢病毒载体 

学科分类：0905[农学-林学类] 09[农学] 

D　O　I：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.026

馆 藏 号：203124319...