基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

作     者：张敏琳 黄枫淇 左小玲 梁建韬 梁凯珊 单金红 李宗烊 喻婕 罗丽媛 禤梓杰 赵会宏 王庆 ZHANG Min-Lin;HUANG Feng-Qi;ZUO Xiao-Ling;LIANG Jian-Tao;LIANG Kai-Shan;SHAN Jin-Hong;LI Zong-Yang;YU Jie;LUO Li-Yuan;XUAN Zi-Jie;ZHAO Hui-Hong;WANG Qing

作者机构：华南农业大学海洋学院广州510642 华南农业大学粤港海洋生物资源保护与开发联合实验室广州510642 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(42176103) 国家重点研发计划(2022YFD2400502) 广东省自然科学基金面上项目(2022A1515012505)资助 

出 版 物：《水生生物学报》 (Acta Hydrobiologica Sinica)

年 卷 期：2024年第48卷第2期

页      码：283-291页

摘      要：为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。

主 题 词：大口黑鲈弹状病毒 CRISPR-Cas13a MIRA 大口黑鲈 

学科分类：0906[农学-水产类] 09[农学] 

核心收录：

D　O　I：10.7541/2023.2023.0199

馆 藏 号：203124589...