利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD载体及效率检测

作     者：吴雅婕 杨跃飞 范博钧 徐磊 鞠辉明 WU Yajie;YANG Yuefei;FAN Bojun;XU Lei;JU Huiming

作者机构：扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 

基　　金：国家自然科学基金(31872323) 江苏省自然科学基金(BK20201224) 江苏高校优势学科建设工程资助(2018) 江苏高校品牌专业建设工程资助(TAAP2018-2022) 

出 版 物：《广西师范大学学报（自然科学版）》 (Journal of Guangxi Normal University:Natural Science Edition)

年 卷 期：2023年第41卷第6期

页      码：132-138页

摘      要：为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测,本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统,根据PPARD基因结构和序列特点,设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列,将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞,提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后,通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现,PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比,PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体,并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑,将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率,推进对PPARD基因的功能研究。

主 题 词：猪 PPARD CRISPR/Cas9 基因编辑 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 0905[农学-林学类] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090501[090501] 090102[090102] 

D　O　I：10.16088/j.issn.1001-6600.2022121803

馆 藏 号：203124819...