SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

作     者：黄少婷 李友 吴钊淳 何嘉文 廖科棋 李胜男 HUANG Shaoting;LI You;WU Zhaochun;HE Jiawen;LIAO Keqi;LI Shengnan

作者机构：广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002 

基　　金：国家自然科学基金项目(81571157) 广东省卫生厅医学科研基金项目(A2022139) 广东省湛江市科技局科技攻关计划项目(2021B01370) 广东医科大学青年培育基金项目(GDMUQ2021006) 

出 版 物：《吉林大学学报（医学版）》 (Journal of Jilin University：Medicine Edition)

年 卷 期：2023年第49卷第6期

页      码：1424-1430页

摘      要：目的:构建性别决定区Y盒17 (SOX17)过表达慢病毒载体,使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。方法:在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列,将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接,构建GV492-SOX17过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌,克隆后测序。将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中,转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组,空白组不作处理,GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞(感染复数=100),10 mg·L^(-1)嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞,荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。结果:GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp,GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒滴度均为2.5×108TU·mL^(-1)。各组PC12细胞生长状态良好且有绿色荧光表达。RT-qPCR法检测,与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量44 000处出现特异性条带,提示PC12细胞中SOX17蛋白表达成功;与空白组和GV492对照组比较,GV492-SOX17组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:成功构建了GV492-SOX17慢病毒表达载体,建立了稳定过表达GV492-SOX17的PC12细胞系。

主 题 词：性别决定区Y盒17 慢病毒载体 PC12细胞 实时荧光定量PCR 感染复数 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 071009[071009] 09[农学] 0901[农学-植物生产类] 090102[090102] 

D　O　I：10.13481/j.1671‑587X.20230603

馆 藏 号：203125312...