利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

作     者：高登科 马白荣 郭怡莹 刘薇 刘田 靳亚平 江舟 陈华涛 GAO Deng-ke;MA Bai-rong;GUO Yi-ying;LIU Wei;LIU Tian;JIN Ya-ping;JIANG Zhou;CHEN Hua-tao

作者机构：西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室杨凌712100 四川大学国家卫生健康委员会时间生物学重点实验室成都610000 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(32373088,31771301) 国家卫生健康委员会时间生物学重点实验室(四川大学)开放基金资助项目(NHCC-2022-01) 中国食品科学技术学会食品科技基金-雅培食品营养与安全专项科研基金(2022-F06) 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2024年第40卷第2期

页      码：65-72页

摘      要：【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。

主 题 词：Quaking CRISPR/Cas9 小鼠胚胎成纤维细胞 基因敲除 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0879

馆 藏 号：203125323...