CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

作     者：王伟 邱志楠 李爽 白向东 刘桂丰 姜静 WANG Wei;QIU Zhinan;LI Shuang;BAI Xiangdong;LIU Guifeng;JIANG Jing

作者机构：林木遗传育种全国重点实验室(东北林业大学)黑龙江哈尔滨150040 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFD2200103) 

出 版 物：《南京林业大学学报（自然科学版）》 (Journal of Nanjing Forestry University：Natural Sciences Edition)

年 卷 期：2024年第48卷第1期

页      码：11-17页

摘      要：【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×***)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示:Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件下培养25 d左右可获得幼嫩愈伤组织,以其为受体在轰击距离为12 cm、7584.5 kPa条件下,用包被Cas9蛋白与gRNA(RNP)金粒进行轰击,随后经过分化培养及继代培养可获得叶色呈现黄绿色的glkc突变株,测序结果显示,该突变株的BpGLK1基因产生18 bp的纯合缺失突变。【结论】利用CRISPR/Cas9编辑技术可实现无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变。

主 题 词：CRISPR/Cas9系统 无T-DNA插入 基因编辑 白桦 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 090701[090701] 0907[农学-草药学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

核心收录：

D　O　I：10.12302/j.issn.1000-2006.202204012

馆 藏 号：203125838...