人白细胞介素-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒的构建及其在HEK293T细胞中的活性验证

作     者：周海金 吴珊 刘丽媛 蒋丹 许涛 蓝华滔 舒纬童 徐广贤 ZHOU Haijin;WU Shan;LIU Liyuan;JIANG Dan;XU Tao;LAN Huatao;SHU Weitong;XU Guangxian

作者机构：广东医科大学医学技术学院医学检验系广东东莞523000 宁夏医科大学临床医学院宁夏银川750004 

基　　金：国家自然科学基金(81860355) 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2024年第37卷第2期

页      码：151-159页

摘      要：目的 构建人白细胞介素(interleukin,IL)-26慢病毒表达质粒与基因敲除质粒,为研究IL-26基因在细胞信号通路及细胞自噬中的功能奠定基础。方法 利用RT-PCR从人外周血单个核细胞中扩增IL-26基因序列,克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP真核表达载体中,构建过表达质粒;并根据IL-26外显子序列设计4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2,利用CRISPR/Cas9技术构建至lentiCRISPRv2载体中,构建基因敲除质粒。将过表达质粒和基因敲除质粒分别瞬时转染至HEK293T细胞,利用RT-qPCR和Western blot验证IL-26 mRNA和蛋白的表达情况。并对IL-26进行氨基酸序列分析、结构预测及亚细胞定位观察。结果 通过酶切、测序鉴定及生物信息学分析显示,IL-26全长516 bp,编码171个氨基酸。IL-26过表达质粒转染的HEK293T细胞与正常对照组相比,IL-26 mRNA水平升高了656.789倍,蛋白质水平升高了1.978倍,差异均有统计学意义(t分别为17.976和7.859,P分别<0.000 1和<0.001)。4个敲除靶点Exon1sgRNA1、Exon1sgRNA2、Exon3sgRNA1、Exon3sgRNA2质粒转染至HEK293T细胞中后,IL-26的表达水平分别下降了0.930、0.980、0.523 3和0.316 9倍,其中Exon3-sgRNA2质粒能够显著下调IL-26的表达(t=7.440,P <0.001)。IL-26蛋白的前22个氨基酸存在信号肽结构,且具有一定的跨膜功能,IL-26存在于细胞质中。结论 成功构建了IL-26过表达和基因敲除质粒,为后续IL-26功能的研究奠定了基础。

主 题 词：白细胞介素-26 过表达质粒 基因敲除质粒 生物信息学 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13200/j.cnki.cjb.003858

馆 藏 号：203126039...