屋尘螨过敏原Der p 4的克隆、表达、免疫原性鉴定及生物信息学分析

作     者：李启松 杨李 腾飞翔 马桂芳 LI Qisong;YANG Li;TENG Feixiang;MA Guifang

作者机构：江苏医药职业学院公共卫生与管理学院盐城224005 

基　　金：江苏省高校哲学社会科学研究项目(2019SJA2332) 江苏高校哲学社会科学研究基金(2018SJA1582) 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2024年第42卷第1期

页      码：42-47页

摘      要：目的克隆表达屋尘螨过敏原Derp 4重组蛋白,鉴定其免疫原性并对其生物信息学进行分析。方法根据已知Derp4基因序列,设计PCR引物,提取屋尘螨总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增Derp4基因。将测序正确的基因片段克隆至pET-28a(+)载体,提取质粒测序鉴定,将重组质粒转入Rosetta2(DE3)pLysS感受态细胞,1 mmol/LIPTG诱导表达后,采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的表达情况。亲和层析法纯化重组蛋白后,以屋尘螨过敏患者血清为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。以纯化后的重组蛋白为包被抗原,间接ELISA法检测30份尘螨过敏患者血清IgE,鉴定其特异性。利用ProtParam tools、SignalP5.0、NetPhos3.1、CD-search、Alphafold、Immune Epitope Database and Analysis Resource(IEDB)等软件和生物信息学预测抗原肽(BPAP)系统等对Derp 4的理化性质、信号肽序列、磷酸化位点、二级和三级结构及B细胞抗原表位进行生物信息学分析。结果RT-PCR扩增出长度为1090 bp的条带。重组质粒测序结果显示,插入的片段为全长1090 bp的Derp 4基因序列。SDS-PAGE分析结果显示,Derp 4重组蛋白为包涵体蛋白,相对分子质量(Mr)约60000,经纯化后的重组蛋白纯度>90%。Western blotting分析结果显示,Derp 4重组蛋白可与尘螨过敏患者血清中的IgE特异性结合,在Mr60000处有明显条带。间接ELISA检测结果显示,Der p 4重组蛋白与14份(46.67%)尘螨过敏患者血清呈特异性IgE结合。生物信息学分析显示,Der p 4蛋白稳定性较高,无信号肽结构,二级结构和三级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主;IEDB和BPAP系统预测到Derp4蛋白存在15个B细胞抗原表位肽序列。结论纯化的Der p 4重组蛋白具有免疫原性,与屋尘螨过敏患者血清中的IgE抗体结合较好。

主 题 词：屋尘螨 Der p 4 克隆 表达 蛋白纯化 免疫学鉴定 生物信息学 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100103[100103] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.12140/j.issn.10007423.2024.01.006

馆 藏 号：203126673...