基于CRISPR/Cas9构建伪结核棒状杆菌cp40敲除株及其生物学特性与致病性研究

作     者：吕红 李鑫灿 牛禄婷 王芝英 周作勇 LÜHong;LI Xincan;NIU Luting;WANG Zhiying;ZHOU Zuoyong

作者机构：西南大学动物医学院重庆402460 

基　　金：重庆市自然科学基金(cstc2021jcyj-msxm X0884) 重庆市现代农业产业技术体系(CQMAITS202313) 中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2020B016) 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2024年第64卷第7期

页      码：2453-2464页

摘      要：【目的】建立更高效的伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)靶基因敲除方法,敲除丝氨酸蛋白酶编码基因(cp40),并评价其在Cp感染致病中的作用。【方法】以p ECXK99E为载体,Cp宣汉株(XH02)cp40为靶基因,设计含CRISPR/Cas9的间隔序列(spacer)、导向RNA(guide RNA,g RNA)和cp40上下游同源臂的表达质粒(p EC-cp40g RNA-HDarm),转入含p Cas9g RNA-ccd B的Cp感受态细胞,构建CRISPR/Cas9基因编辑系统以敲除cp40基因。通过比较cp40敲除株和野生株的菌落形态及生长曲线、体外对J774A.1巨噬细胞活力及白细胞介素(interleukin,IL)-1β分泌,以及体内感染小鼠致死率及脏器载菌水平,研究cp40与该病原感染致病之间的关系。【结果】应用所建立的双质粒CRISPR/Cas9编辑系统成功获得XH02的cp40敲除株(XH02Δcp40)。与XH02相比,XH02Δcp40在菌落形态及生长曲线上无明显差异,但XH02Δcp40感染J774A.1巨噬细胞的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放(P=0.06)、碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色比例均降低(P<0.01),体内感染小鼠致死率下降50%,并且被感染小鼠肝脏和肾脏中Cp含量显著降低(P<0.001)。【结论】本研究所建立的CRISPR/Cas9编辑系统可较高效敲除Cp基因,证实cp40是该病原感染致病相关基因,为后续基于该基因研究Cp感染致病机制奠定基础。

主 题 词：CRISPR/Cas9 伪结核棒状杆菌 丝氨酸蛋白酶 基因敲除 致病性 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

核心收录：

D　O　I：10.13343/j.cnki.wsxb.20230789

馆 藏 号：203127403...