基于重组酶介导的等温扩增和CRISPR-Cas13a检测幽门螺杆菌的方法的建立

作     者：王雅轩 刘晓川 朱子潇 胡继红 Wang Yaxuan;Liu Xiaochuan;Zhu Zixiao;Hu Jihong

作者机构：北京医院、国家老年医学中心、国家卫生健康委临床检验中心、中国医学科学院老年医学研究院北京100730 应急总医院消化内科北京100028 重庆医科大学儿科学院重庆400016 

出 版 物：《中华检验医学杂志》 (Chinese Journal of Laboratory Medicine)

年 卷 期：2024年第47卷第6期

页      码：686-692页

摘      要：目的开发一种基于重组酶介导的等温扩增(RAA)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas13a)系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列,设计RAA-Cas13a核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA(crRNA)。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对,并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列,构建了RAA-Cas13a核酸检测体系,通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA,评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法同时检测临床菌株,得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对t检验对两组间的荧光值进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA(t=11.05,P<0.01),且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性,Kappa系数为1。结论建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法,可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

主 题 词：螺杆菌,幽门 核酸检测 感染 基因 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100201[100201] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.cn114452-20240102-00001

馆 藏 号：203128388...