基于Dhori病毒GP蛋白间接ELISA检测方法的建立

作     者：汪烘宇 高赟 马晓芹 朱忠正 富玉姣 晁小珊 靳军霞 丁军涛 WANG Hongyu;GAO Yun;MA Xiaoqin;ZHU Zhongzheng;FU Yujiao;CHAO Xiaoshan;JIN Junxia;DING Juntao

作者机构：新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046 

基　　金：国家自然科学基金项目(81960369,81760365) 新疆高校科研计划自然科学重点项目(XJEDU2019I002) 

出 版 物：《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)

年 卷 期：2024年第54卷第7期

页      码：888-895页

摘      要：本研究利用原核表达系统表达Dhori病毒(DHOV)糖蛋白(GP),以此为抗原建立间接ELISA检测方法。根据DHOV-GRT169毒株GP基因设计引物并扩增得到去除跨膜区与信号肽的基因片段,构建了重组表达质粒p ET-32a-GP,测序验证正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组GP蛋白。以DHOV阳性山羊血清为一抗,经Western-blot检测纯化蛋白后,以纯化的p ET-32a-GP为包被抗原,通过方阵滴定法优化反应条件,建立检测DHOV血清抗体的间接ELISA检测方法,评价其重复性、敏感性和特异性。采用建立的间接ELISA检测方法检测新疆部分地区采集的不同动物血清样本中DHOV抗体。结果显示,pET-32a-GP原核表达质粒构建正确,GP蛋白大小约为66.8 ku,反应原性良好;ELISA条件优化确定的最佳包被浓度为4μg/m L、一抗稀释度为1∶1000、一抗孵育时间为30min、二抗稀释度为1∶3000、二抗孵育时间为30 min、TMB显色时间为4 min;重复性试验结果表明,批内与批间变异系数(CV)均<10%;敏感性试验表明,当阳性血清稀释度为1∶1400时具有良好的敏感性;特异性试验表明,建立的间接ELISA检测方法检测GTV、CCHFV和TAMV时呈阴性反应;随机选取343份采于新疆不同地区的动物血清进行ELISA检测,检出48份血清结果呈阳性,阳性检出率为13.99%。该检测方法的建立为DHOV的流行病学分析提供了基础,为进一步研究DHOV GP蛋白的生物学功能、检测试剂盒的开发以及疫苗的研制提供了理论依据。

主 题 词：Dhori病毒 GP蛋白 原核表达 间接ELISA 

学科分类：090601[090601] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0091

馆 藏 号：203128584...