7种细菌性虫媒病病原体的反向线状印迹杂交检测技术的建立

作     者：李雅琪 叶得河 马永华 LI Yaqi;YE Dehe;MA Yonghua

作者机构：甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 

基　　金：甘肃农业大学学科建设专项基金项目(GUA-XKJS-2018-073) 甘肃农业大学青年导师基金项目(GAU-QDFC-2020-11) 甘肃农业大学人才专项经费项目(2017RCZX-11) 甘肃省科技厅重点研发项目(18YF1FA080) 甘肃省科技厅国际合作项目(144WCGA169) 国家自然科学基金项目(32160843) 甘肃省现代丝路寒旱农业科技支撑项目(GSLK-2021-18) 甘肃省自然科学基金项目(18JR3RA167) 

出 版 物：《甘肃农业大学学报》 (Journal of Gansu Agricultural University)

年 卷 期：2024年第59卷第3期

页      码：31-39页

摘      要：【目的】建立快速高效的细菌性虫媒病的检测方法。【方法】运用反向线状印迹杂交技术(reverse line blot,RLB),通过对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica *** serovar Typhimurium)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对,利用DNAStar和Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物(RLB-F,RLB-R),和特异性探针以及通用探针(Catch-all),通用下游引物(RLB-R)5 端用生物素标记和探针5 端连接氨基团(NH_(2)^(+))。【结果】成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法,并确定了通用引物最佳浓度为25μmol/L,金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌探针的最佳浓度分别为50μmol/L,其他5种病原探针的最佳浓度为100μmol/L。使用PCR-RLB检测方法,可对上述7种细菌的检测敏感性可达到10^(-6)~10^(-11) ng/μL,远远高于PCR的10^(-3)~10^(-8) ng/μL。【结论】首次同时对7种细菌进行检测,并确定了不同引物及探针的最佳浓度。该方法不仅提高了检测效率,同时还提高了检测的灵敏度,为开发新的检测手段提供了理论依据。

主 题 词：细菌性虫媒病 反向线状印迹杂交技术 PCR扩增 

学科分类：090603[090603] 09[农学] 0906[农学-水产类] 

D　O　I：10.13432/j.cnki.jgsau.2024.03.004

馆 藏 号：203128735...