尿激酶型纤溶酶原激活物生物传感器的构建及鉴定

作     者：崔钢华 饶烽 王琰 曹薇薇 刘伟 王维山 史晨辉 CUI Ganghua;RAO Feng;WANG Yan;CAO Weiwei;LIU Wei;WANG Weishan;SHI Chenhui

作者机构：石河子大学医学院第一附属医院骨一科新疆石河子832000 石河子大学新疆地方民族与地方病教育部重点实验室新疆石河子832000 

基　　金：国家自然科学基金资助课题(81160225 81260453 81360451) 新疆兵团医药卫生专项基金资助课题(2013BA020) 新疆兵团国际交流与合作专项基金资助课题(2012BC002 2011BC004) 新疆兵团科技创新团队专项基金资助课题(2014CC002) 

出 版 物：《吉林大学学报（医学版）》 (Journal of Jilin University：Medicine Edition)

年 卷 期：2015年第41卷第6期

页      码：1124-1129,I0012页

摘      要：目的:构建含有增强型青色荧光蛋白-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)融合蛋白的真核表达载体(ECFP-uPA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器。方法:以Src-biosensor为模板,Primer Premier 5.0软件设计YPet引物,设计时5′端引入uPA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以pMDTM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表达载体。然后转染293T细胞,24h后观察转染效率和融合蛋白表达情况,在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件观察并测量uPA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与uPA substrate分子大小相符。细胞转染后转染效率达40%。免疫荧光检测,uPA生物传感器在293T细胞膜表达,用重组人uPA(rhuPA)刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结论:成功构建uPA生物传感器,该生物传感器能够作为活细胞分子探针用于研究uPA的时空变化。

主 题 词：尿激酶型纤溶酶原激活物 生物传感器 荧光共振能量转移 骨性关节炎 

学科分类：1007[医学-药学类] 1002[医学-临床医学类] 1001[医学-基础医学] 10[医学] 

D　O　I：10.13481/j.1671-587x.20150605

馆 藏 号：203128952...