慢病毒介导的具有特定二级结构的microRNA-338-3p抑制剂的构建

作     者：邓海军 孙凯 郭琛 董泾青 李国新 DENG Hai-jun;SUN Kai;GUO Chen;DONG Jing-qing;LI Guo-xin

作者机构：南方医科大学南方医院普通外科广州510515 南方医科大学生物技术学院 

基　　金：国家自然科学基金青年基金资助项目(81101896) 

出 版 物：《中华实验外科杂志》 (Chinese Journal of Experimental Surgery)

年 卷 期：2013年第30卷第1期

页      码：80-83页

摘      要：目的构建慢病毒介导的具有特定二级结构的人microRNA-338-3p（miR．338．3p）抑制剂并观察其对结直肠癌细胞侵袭转移能力的影响。方法由miRBase数据库查找获得miR-338-3p成熟序列，设计目的基因片段并人工合成；将miR-338-3p抑制剂序列和pLV-THM载体经双酶切后连接，产生pLV-THM-miR-338-3p抑制剂慢病毒表达载体，双酶切后测序鉴定，筛选阳性克隆；以pLV-THM-miR-338-3p抑制剂、psPAX2和pMD2．G质粒共转染包装细胞293T，包装产生慢病毒并测定滴度。流式细胞仪筛选建立稳定过表达miR-338-3p抑制剂的SW-620亚细胞株，利用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-338-3p表达，Westernblot检测其靶基因Smoothened（SMO）蛋白表达水平，Transwell小室穿透试验检测肿瘤细胞转移能力。结果经双酶切鉴定和测序证实，成功构建了包含miR-338-3p抑制剂的慢病毒表达载体，倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293T表达绿色荧光。稳定过表达miR-338-3p抑制剂的SW-620亚细胞株中，miR-338．3p表达水平显著低于阴性对照组（O．92±0．43比3．71±0．22，P〈0．01），SMO蛋白表达水平明显升高，且肿瘤细胞表现出侵袭转移能力的增强（细胞数78．6±6．9比23．7±4．2，P〈0．01）。结论成功构建了miR-338-3p抑制剂的慢病毒表达载体和稳定低表达miR-338-3p的SW-620亚细胞株，证实miR-338-3p可通过抑制结直肠癌细胞中SMO蛋白表达而抑制肿瘤细胞转移。

主 题 词：结直肠癌 MicroRNA-338-3p 慢病毒 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2013.01.026

馆 藏 号：203130353...