靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选

作     者：周蔚 徐忠伟 王凤梅 陈小义 呼文亮 徐瑞成 Zhou Wei;Xu Zhongwei;Wang Fengmei;Chen Xiaoyi;Hu Wenliang;Xu Ruicheng

作者机构：中国人民武装警察部队医学院细胞生物学与遗传学教研室天津300162 中国人民武装警察部队医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室天津300162 天津市第三中心医院肝内科天津300171 

基　　金：国家自然科学基金(0840010) 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2010年第26卷第11期

页      码：212-218页

摘      要：构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPaseα1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响。构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功。ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPaseα1mR-NA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05)。ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPaseα1mRNA呈时间依赖性,72h后表达降低约90%。试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显著抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞。

主 题 词：钠钾ATP酶 RNA干扰 HepG2细胞 细胞周期 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 090102[090102] 

D　O　I：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.11.025

馆 藏 号：203131071...