基于成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术的高迁移率族蛋白B2基因敲除巨噬细胞Raw264.7细胞株的构建与功能鉴定

作     者：白丽民 徐刚 张筱薇 李笑眉 龚政 汪佳希 韩雨佳 Bai Limin;Xu Gang;Zhang Xiaowei;Li Xiaomei;Gong Zheng;Wang Jiaxi;Han Yujid

作者机构：苏北人民医院烧伤整形科扬州225001 扬州大学临床医学院扬州225001 大连医科大学研究生院大连116044 

出 版 物：《中华实验外科杂志》 (Chinese Journal of Experimental Surgery)

年 卷 期：2024年第41卷第7期

页      码：1457-1460页

摘      要：目的通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7), 并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA), 将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞, 利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2-/- Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力, 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2-/- Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用t检验。结果利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株, HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达, HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较, 差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15, t=0.17, P>0.05), 但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%, t=5.62, P<0.01];KP感染HMGB2-/- Raw264.7, 促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml, t=5.00, P<0.01;(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml, t=3.36, P<0.01;(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml, t=3.68, P<0.05]。结论通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株, 验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

主 题 词：CRISPR/Cas9技术 高迁移率族蛋白B2 巨噬细胞 肺炎克雷伯菌 

学科分类：1002[医学-临床医学类] 100214[100214] 10[医学] 

D　O　I：10.3760/cma.j.cn421213-20231010-00223

馆 藏 号：203131614...