针对副溶血性弧菌toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a荧光快速检测方法的建立及应用

作     者：侯雅超 邢微微 王亚楠 刘新萍 董优优 周光 陈昌国 HOU Ya-chao;XING Wei-wei;WANG Ya-nan;LIU Xin-ping;DONG You-you;ZHOU Guang;CHEN Chang-guo

作者机构：河北北方学院医学检验学院河北张家口075000 解放军总医院第六医学中心检验科北京100048 军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所北京100850 解放军总医院第一医学中心检验科北京100853 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81401311) 

出 版 物：《中华医院感染学杂志》 (Chinese Journal of Nosocomiology)

年 卷 期：2024年第34卷第14期

页      码：2081-2086页

摘      要：目的探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00%;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.

主 题 词：副溶血性弧菌 重组酶聚合酶扩增 成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a 快速检测 可视化 

学科分类：1010[医学-医学技术类] 10[医学] 

D　O　I：10.11816/cn.ni.2024-231474

馆 藏 号：203131620...