腺病毒介导靶向碱性成纤维细胞生长因子siRNA载体的构建及鉴定

作     者：刘家美 刘俊 冯学泉 徐新女 刘宏胜 张飚 吴静超 王金环 

作者机构：天津市第四中心医院神经内科天津300140 天津市环湖医院神经外科天津300060 天津市第一中心医院神经外科天津300192 天津市第一中心医院卫生部危重病急救医学重点实验室天津300192 

基　　金：国家自然科学基金(81101911) 天津市科委抗癌重大专项攻关计划项目(127cdzsy17700) 天津市卫生局科技基金重点资助项目(2012KR07) 

出 版 物：《肿瘤防治研究》 (Cancer Research on Prevention and Treatment)

年 卷 期：2014年第41卷第11期

页      码：1186-1189页

摘      要：目的构建一种高效"沉默"碱性成纤维细胞生长因子的小干扰RNA重组腺病毒载体,并为该载体在基因研究中提供相关资料。方法设计、合成优选的靶向bFGF特异性siRNA序列。采用限制性内切酶消化和T4 DNA连接酶连接的方法,将bFGF-siRNA序列克隆至腺病毒穿梭质粒pGStrack上,然后将重组穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA和腺病毒骨架质粒pGSadeno体外LR位点进行特异性重组,将bFGF-siRNA基因转移至腺病毒骨架质粒pGSadeno上,最后重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA。鉴定正确后经Pac Ⅰ酶切,转染HEK 293细胞,包装成重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA。同时在HEK 293细胞中进行病毒扩增,利用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用微量全细胞病变法检测腺病毒滴度,用Western blot方法验证所构建载体作用效果。结果 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA构建成功;扩增后检测腺病毒滴度约为5×108 PFU/ml,Western blot结果显示目的基因蛋白沉默效率大于90%。结论应用LR重组法能成功构建携带靶向bFGF基因的siRNA重组腺病毒,该载体转染胶质瘤U251细胞株后目的基因蛋白沉默效率较高,为进一步的相关研究奠定可靠的基础。

主 题 词：碱性成纤维细胞生长因子 腺病毒 载体 小分子干扰RNA 

学科分类：1001[医学-基础医学] 100104[100104] 10[医学] 

D　O　I：10.3971/j.issn.1000-8578.2014.11.006

馆 藏 号：203132091...