CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象

作     者：张悦 许杰 王珩瑜 盛勇 欧一新 王斌 张蓓 康前进 张丽 ZHANG Yue;XU Jie;WANG Hengyu;SHENG Yong;OU Yixin;WANG Bin;ZHANG Bei;KANG Qianjin;ZHANG Li

作者机构：青岛大学青岛医学院基础医学院山东青岛266071 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240 上海交通大学代谢与发育国际联合合作实验室上海200240 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFC2100600) 上海市农业科技创新项目(202302080012F04596) 合成生物学海河实验室重大攻关类项目(22HHSWSS00001) 

出 版 物：《微生物学报》 (Acta Microbiologica Sinica)

年 卷 期：2024年第64卷第8期

页      码：2998-3013页

摘      要：【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD_(600)进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA,发现靶向lacZ时,MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了***宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

主 题 词：大肠杆菌 CRISPR/LshCas13a 质粒干扰系统 逃逸现象 插入序列 

学科分类：0710[理学-生物科学类] 1007[医学-药学类] 100705[100705] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[071007] 0901[农学-植物生产类] 0836[0836] 071005[071005] 090102[090102] 10[医学] 

核心收录：

D　O　I：10.13343/j.cnki.wsxb.20240081

馆 藏 号：203132436...